Cell: 刘默芳团队揭示精子细胞蛋白质翻译激活机制丨CellPress对话科学家

PIWI 蛋白特异性地在动物生殖系统中表达，为动物生殖细胞发育分化和配子形成所必需。PIWI蛋白主要通过与一类动物生殖细胞特异性小分子非编码RNA—piRNA结合形成PIWI/piRNA功能复合物，在表观遗传和转录后水平沉默基因组中转座遗传元件，维持动物生殖细胞基因组的稳定性和完整性；此外，PIWI/piRNA还可以在转录后水平负调控mRNA，参与了生殖细胞中编码基因的表达调控【1, 2】。

2019年12月12日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所，简称“分子细胞中心”）刘默芳研究组、武汉大学生科院周宇研究组和上海计划生育研究所施惠娟研究组与国内外多家实验室合作，在Cell Press细胞出版社旗下Cell（《细胞》）期刊以“A Translation-Activating Function of MIWI/piRNA during Mouse Spermiogenesis”为题，报道了MIWI/piRNA激活小鼠精子细胞中mRNA的翻译，从而保障功能性精子的生成。

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在哺乳动物中，减数分裂以后的雄性生殖细胞发育将经历一系列的剧烈细胞形态变化，包括顶体和鞭毛形成、细胞核压缩和细胞质丢弃等，此过程被称为精子形成（spermiogenesis）。小鼠的精子形成可划分为16个连续转化步骤，包括球形精子细胞期（round spermatid；第1-8步）、延长型精子细胞期（elongating spermatid；第9和10 步）、长形精子细胞期（elongated spermatid；第12-14步）和精子（spermatozoa；第15-16步）。这些连续转化的发育步骤受到一系列特异性表达基因的协同调控。在单倍体精子细胞演变为精子的过程中，伴随精子细胞形态变化和染色质压缩，细胞核内的基因转录活动将逐渐减少直至完全停止，那些为精子细胞后期发育阶段所需的基因都需要提前转录为信使核糖核酸（mRNA），然后以翻译抑制状态储存在精子细胞中，直到特定发育阶段再被激活翻译，以合成蛋白质发挥作用。这个现象就是精子形成过程中著名的“转录-翻译解偶联”，但如何激活那些被抑制的mRNA从而完成蛋白翻译？这仍然是生殖生物学中的一个不解之谜。

刘默芳研究组的前期研究发现，小鼠PIWI（MIWI）/piRNA通过类似miRNA或siRNA的机制，在小鼠后期精子细胞中指导mRNA降解和清除【3,4】。在利用报告基因筛选鉴定piRNA靶基因过程中，博士后戴鹏、王鑫及其同事意外地发现，一些piRNA可促进其靶mRNA的翻译，暗示piRNA可能参与了精子细胞中的“转录-翻译解偶联”调控。随后，通过大量生化实验和细胞生物学实验，他们鉴定了与MIWI蛋白直接相互作用的真核生物翻译起始因子eIF3f 、识别mRNA顺式元件ARE的RNA结合蛋白HuR等多个蛋白质因子，为MIWI/piRNA激活靶mRNA翻译必需；推测在这些蛋白质因子协助下，MIWI/piRNA通过促进mRNA “loop”结构形成，激活翻译起始（图1）。

 图1. MIWI/piRNA激活靶mRNA翻译的工作模型

随后，研究人员通过比较小鼠精母细胞和单倍体精子细胞中靶基因的mRNA和蛋白表达水平，发现piRNA靶基因受控于“转录-翻译解偶联”调控，并证明MIWI、HuR等为靶基因的蛋白表达必需（图2）。进一步，通过核糖体印迹测序和定量蛋白组分析，发现精子细胞中有一大群mRNA的翻译可能都受控于piRNA系统，显示这种新发现的piRNA调控作用参与激活了精子细胞大量mRNA的翻译。

图2. 敲低Miwi和HuR抑制了精子细胞中piRNA靶基因的翻译

外翻而调控凝血反应

为探索这种piRNA新功能的生物学意义，研究人员围绕对顶体组装至关重要的两个靶基因Agfg1和Tbpl1【5,6】，发现从Miwi敲低精子细胞衍生而来的精子发生了严重的顶体缺陷，而通过在Miwi敲低精子细胞中恢复Agfg1和Tbpl1的表达，可有效拯救精子的顶体缺陷（图3），证明这种新发现的翻译调控机制至少为精子细胞发育过程中的顶体组装必需。

图3. 恢复Miwi敲低精子细胞中Agfg1和Tbpl1的表达有效拯救了精子的顶体缺陷

研究人员进一步探索了为何MIWI/piRNA可以在精子细胞中发挥激活翻译和促进mRNA降解等两种截然相反的作用？通过分析在不同发育阶段雄性生殖细胞中的MIWI复合物组成，研究人员发现MIWI/eIF3f/HuR翻译激活复合物主要在球形精子细胞中组装（图4）。而他们之前的工作发现，与脱腺苷酶CAF1组成的MIWI/CAF1降解复合物主要在延长型和长形精子细胞中组装【3】。这些发现显示，MIWI/piRNA在小鼠精子细胞中对mRNA的调控具有双重性，在早期阶段精子细胞中主要通过与eIF3f和HuR相互作用激活mRNA翻译，而在后期精子细胞中则主要通过与CAF1相互作用启动mRNA清除降解（图5）。

图4. MIWI/eIF3f/HuR复合物主要在球形精子细胞中组装

图5. MIWI/piRNA 在小鼠精子细胞中对靶mRNAs发挥双重调控作用

据不完全统计，我国近20年不孕不育率从6.9% 升至17.1%，其中近50%是男性因素导致。环境污染、生活压力、遗传突变等因素是造成男性不育的重要原因，但目前有一半以上不育男性无法明确其病因【7】。刘默芳研究组此前在男性不育症患者中鉴定到一类拮抗人PIWI蛋白泛素化修饰的Piwi基因突变，并证明此类突变通过影响精子形成后期组蛋白-鱼精蛋白交换而导致精子形成受阻，首次证明了Piwi基因突变与男性不育相关【8】。当前这项研究工作发现MIWI/piRNA介导精子细胞中翻译激活，不仅为解析精子形成过程中“转录-翻译解偶联”这个重要生物学问题提供了新线索，还将有助于揭示精子形成障碍的致病机理，并为相关男性不育症的相关诊断治疗提供理论依据和方法技术。

Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者刘默芳研究员进行了专访，请她为大家进一步详细解读。

作者专访

Cell Press：在文章中提到当MIWI形成的复合物具有双重调节性，当在延长型和长形精子细胞中MIWI会与CAF1结合起到降解作用而非MIWI/piRNA的启动翻译的作用，那么精子细胞是如何保证MIWI在正确的时间与正确的分子进行结合呢？

刘默芳研究员：这个问题我们在论文中有实验数据回答过。通过分析在不同发育阶段雄性生殖细胞中的MIWI复合物组成，我们发现MIWI/piRNA和两类co-factors的结合依赖于精子细胞发育期：在较早发育阶段的球形精子细胞中，MIWI主要与eIF3f和HuR结合，组装MIWI/piRNA/eIF3f/HuR翻译激活复合物，负责激活mRNA的翻译；而在较后发育阶段的延长型精子细胞和长形精子细胞中，MIWI则主要与脱腺苷酶CAF1相互作用，组装MIWI/piRNA/CAF1降解复合物，触发精子形成前胞质mRNA的大规模降解清除、失活各种胞内活动，为精子形成做准备。我们注意到，在后期精子细胞中，eIF3f和HuR的表达剧烈下降，而CAF1蛋白水平基本维持不变，有可能在精子细胞发育过程中，随着eIF3f和HuR的减少，MIWI逐渐转向与CAF1激活。当然，我们不能排除在精子细胞发育过程中存在翻译后修饰或/和其它蛋白质因子，参与调控了MIWI/piRNA和两类co-factors的时空特异性结合。

Cell Press：除生殖细胞外，其他体细胞是否也存在“转录-翻译解偶联”现象？如果存在，本研究是否能对相关领域研究产生参考价值？如果不存在，那么MIWI复合物在体细胞分裂分化中是否起到一定作用？

刘默芳研究员：是的，在体细胞中也会存在“转录-翻译解偶联”现象，比如神经元。从神经元胞体转录出来的一些mRNA不会立即就进入核糖体翻译，而是需要以翻译抑制状态被远程运输到轴突中再激活进行翻译，也是典型的“转录-翻译解偶联”现象。在小鼠胚脑中的确有MIWI/piRNA的表达，或许我们发现的这种翻译调控机制有可能在神经元发育分化中也起到一定作用。

Cell Press：本研究对于男性不育症的相关诊断治疗将会带来哪些影响？

刘默芳研究员：临床有一部分不育症患者表现为无精或少精，精子畸形或死精，但睾丸组织活检样品中能发现大量单倍体精子细胞，其发病原因可能是精子细胞发育异常和精子形成受阻。目前对这类不育症的致病机理尚了解不多，我们今后将针对这类不育症患者进行相关基因突变筛查，解析致精子形成障碍的病理机制，以期为此类男性不育症的精准医疗提供了理论基础和方法策略。

Cell Press：研究过程中是否遇到困难？是如何攻克的？

刘默芳研究员：减数分裂后的单倍体精子细胞发育是一个高度复杂的细胞形态变化和生化反应过程，此过程目前还不能在体外完成。由于缺乏单倍体精子细胞体外培养系统及合适的动物模型，研究此发育过程非常困难，这也导致目前对精子形成的分子基础及调控机制认识还极其有限。为攻克这些难题，本团队在前期研究中建立了高滴度慢病毒小鼠睾丸转导技术，可方便地干预单倍体精子细胞中特定基因的表达，并追踪其对精子形成的影响，实现体内研究特定基因在精子细胞发育中的功能。同时，我们还建立完善了小鼠生精细胞分选技术，可获得高纯度的不同发育期的生精细胞。这些方法技术和研究系统极大地方便了我们研究精子形成的调控机制。

Cell Press：您团队的后续的研究将关注哪些方面？

刘默芳研究员：“转录-翻译解偶联” 现象是生殖生物学中的一个fundamental生物学问题。我们当前这个研究发现MIWI/piRNA负责在球形精子细胞中激活一组mRNA完成蛋白翻译，但我们还不清楚在延长型精子细胞及长形精子细胞翻译激活是通过何种机制实现的？我们的后续研究将继续关注此方向的研究，同时还将关注这些调控作用在临床男性不育患者中是否存在异常，希望揭示精子形成障碍的致病机理。

本文参考文献 （上下滑动查看）

1. Klattenhoff C. and Theurkauf W. (2008). Biogenesis and germline functions of piRNAs. Development 135, 3-9.

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8. Gou, L.T., Kang, J.Y., Dai, P., Wang, X., Li, F., Zhao, S., Zhang, M., Hua, M.M., Lu, Y., Zhu, Y., Li, Z., Chen, H., Wu, L.G., Li, D., Fu, X.D., Li, J., Shi, H.J., Liu, M.F. (2017). Ubiquitination-Deficient Mutations in Human Piwi Cause Male Infertility by Impairing Histone-to-Protamine Exchange during Spermiogenesis. Cell 169, 1090-1104.

论文通讯作者介绍

关于 刘默芳 研究员

分别于1991年、1994年在华东理工大学获学士、硕士学位，2000年在中科院上海生物化学研究所获博士学位。分别于2000 -2005年、2005-2006年在美国国家健康研究院癌症研究所 (National Cancer Institute, NIH)博士后研究、约翰霍浦金斯医学院遗传和分子生物学系任研究助理。2006-至今，中科院上海生化细胞所，先后担任co-PI、RNA研究技术平台主任、研究组长。2013年入选国家杰出青年科学基金获得者。担任多本期刊编委、中国生物化学与分子生物学会理事会理事及RNA专业委员会副主任。

实验室主页：http://www.sibcb.ac.cn/PI.asp?id=135

相关论文信息

论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文

论文标题：

A Translation-Activating Function of MIWI/piRNA during Mouse Spermiogenesis

论文网址：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31278-4

DOI:

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.022

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